Basé à Duxford au début de la guerre, le Squadron 66 est une des premières unités de Spitfire à être engagée au combat en mai 1940, opérant le long des côtes Hollandaises lors du lancement de l'invasion de l'Europe par l'Allemagne au matin du 10 mai. La première victoire est remportée le 12 mai et le 16 le Squadron est envoyé à Horsham St Faith puis à Costishall le 29 mai. Au début septembre, alors que la Bataille d'Angeleterre fait rage, le Squadron rejoint le Sud et Kenley pour prendre à la dernère phase de cette bataille décisive. Le Squadron remporte 20 victoire et au début décembre participe à ce qui constitue sans doute l'une des premières missions "Rhubarb" au-dessus de l'Europe occupée.

Dès lors, le Squadron effectue une série de mouvement, passant par Biggin Hilll en novembre et échangeant ses Spitfire I contre des Mk IIa jusqu'en février 1941, époque à laquelle ils sont à nouveau échangés contre des Spitifre I avec un transfert vers l'Ouest à Exeter. Le Squadron stationne alors dans le Sud Ouest de l'Angleterre pour une longue période, recevant des Spitfire V en mars 1942 et effectuant un bref séjour à Tangmere en août 1942 pour prendre part à l'opération "Jubilée" sur Dieppe, le 19 août.

En février 1943, transfert vers l'Ecosse où en mai 1943 les Spitfire V laissent la place à des Spitfire VI. A l'été, le Squadron est transféré dans le Sud et devient totalement opérationnel sur Spitfire Mk VI. Transféré à Hornchurch en novembre 1943, il perçoit des Spitfire LF IXb et intègre la 2nd TAF pour prendre part aux opérations préparatoires du débarquement de Normandie en compagnie des Squadrons 331 et 332 avec lesquel le Squadron 66 forme le Wing 132.

Après l'invasion de la Normandie, le Squadron s'installe en France à la fin août et reçoit des IXe à la place des IXb en septembre avant de passer sur Spitfire XVIe en novembre 1944 après que le Squadron se soit installé en Belgique. En décembre, le Squadron arrive en Hollande et participe dès lors au soutien rapporché des troupes terrestres. Avce l'approche de la fin de la guerre, le Squadron est dissout le 30 avril 1945 après avoir remporté 82 victoires aériennes.