Formé à partir du Flight 421, le Squadron 91 prend sa nouvelle désignation le 11 janvier 1941. Equipé de Spitfire IIa et basé à Hawkinge, il est tout d'abord chargé de mener des missions de reconnaissance côtière. Les premiers Spitfire V arrivent en mars et les derniers Spitfire IIa quittent l'unité en juin. L'activité à basse altitude le long des côtes continue jusqu'en avril 1943 depuis Hawkinge et Lympne lorsque le Squadron est envoyé en repos à Honiley où il effectue sa conversion sur Spitfire XII, la seule unité avec le Squadron 41 à recevoir le Spitfire à moteur Griffon.

Une fois opérationnelle sur sa nouvelle monture, le Squadron retourne à Hawkinge en mai mais opère finalement depuis Wrsthampnett jusqu'en octobre puis à partir de Tangmere ces deux bases formant un Wing qui comprend le Squadron 41. Le Squadron 91 est employé contre les Fw 190 qui désormais effectuent des missions de harcèlement en Grande Bretagne et les hautes performances du Spitfire XII permettent de remporter plusieurs succès permettant au Squadron 91 de devenir le meilleur Squadron du Group 11 en septembre 1943 avec 18 victoires au cours du mois.

En février 1944, le Squadron est envoyé au repos et effectue sa conversion sur Spitfire XIV à Castle Camp. Il s'installe à West Malling en avril 1944 où il est rejoint par les Squadrons 41 et 322 (Hollandais). Juste après le débarquement de Normandie, le Spitfire XIV est sélectionné comme intercepteur pour détruire les bombes volantes V1 qui s'abattent en grand nombre sur l'Angleterre. Le Squadron se révèlera très performant dans cette tâche. Avec la fin des attaques de V1, les Spitfire Mk XIV sont remplacés par des Mk IXb et le Squadron s'installe à Biggin Hill en octobre puis à Manston, base à partir de laquelle le Squadron effectue des escortes de bombardiers sur le Nord Ouest de l'Europe.

Au début 1945, le Squadron est sélectionné pour être le premier à recevoir le nouveau Spitfire F21. Il reprend alors les Sweep et autres reconnaissances armées le long de la côte Hollandaise à partir d'avril mais la guerre se termine sans que la moindre opposition ne permette de tester le nouvel appareil en combat aérien.