Basé à Hornchurch et équipé de Spitfire Mk I au début de la guerre, le Squadron 54 effectue des rotations régulières sur le terrain de Rochford au cours de la première année de guerre. La première victoire est obtenue le 13 février lorsqu'un appareil de reconnaissance Allemand est abattu. Les patrouilles sur la France débutent en mai. Au fur et à mesure du repli du Corps Expéditionnaire Britannique vers Dunkerque les combats ne cessent de s'intensifier et atteindront leur apogée lors de l'opération "Dynamo". Le 28 mai, le Squadron échange sa place avec le Squadron 41 à Catterick mais retourne à Hornchurch le 4 juin 1940.

Au cours de la Bataille d'Angleterre, le Squadron est engagé avec une très forte intensité et en dehors de quelques jours de repos il est constamment en alerte jusqu'au 3 septembre. Il retourne finalement à Hornchurch en février 1941 et échange ses Spitfire I contre des Mk IIa puis en mai contre des Mk Va. Désormais engagé dans les missions trans-Manche, le Spitfire Vb, armé de canons, fait son apparition en juillet 1941. En novembre 1941, le Squadron affiche un tableau de chasse de 135,5 victoires dont 932 obtenues en 1940. c'est à cette époque que le Squadron est envoyé au repos à Castletown en Ecosse.

Après 6 mois passés en Ecosse, le Squadron se prépare à être transféré en Extrême Orient. Il part pour l'Australie en juin 1942 et devient partie intégrante du 1er Wing RAAF basé à Darwin. Le Squadron est alors équipé de Spitfire Vc et remporte sa première victoire sur un avion Japonais le 7 février en abattant un appareil de reconnaissance de type Dinah. Au cours des mois suivants, le Squadron ajoute 25,5 victoires à son palmarès. Le Squadron reste en Australie jusqu'à la fin de la guerre et change ses Spitfire V contre des Spitfire VIII en avril 1944 mais ne prendra plus part aux combats. Début 1944, il a été rejoint par deux Squadrons de la RAF nouvellement formés, les Squadron 548 et 549 et tous équipés de Spitfire VIII Ces deux nouveaux Squadrons sont chargés de remplacer les 452 et 457 de la RAAF qui ont été envoyé en première ligne. Ni le 548 ni le 549 ne prendront part aux combats et leur code respectif sera RS et ZF.