Basé à Hornchurch en septembre 1939, le Squadron 65 est équipé de Spitfire I au début de la guerre. En octobre, il est transféré à Northolt et retourne à Hornchurch fin mars 1940. A partir de mai, le Squadron participe aux opérations aériennes le long de la côte Hollandaise suite au déclenchement de l'attaque Allemande du 10 mai. Il participe ensuite à la couverture de l'évacuation des troupes à Dunkerque dans le cadre de l'opération Dynamo. Lorsqu'elle est envoyé au repos à Kirton in Lindsey pour une courte période, le 28 mai, le Squadron compte 19 victoires.

Le Squadron retourne à Hornchurch au début juin et prend part, au cours de l'été, à la Bataille d'Angleterre jusqu'u 27 août., remportant 32,5 victoires supplémentaires avant d'être envoyé au repos à Turnhouse, en Ecosse. Début novembre, le Squadron fait à nouveau mouvement vers le Sud à Tangmère où il reçoit des Spitfire IIa en janvier 1941. Le Squadron est à nouveau envoyé à Kirton en février 1941 où il reste jusqu'en octobre, accomplissant un grand nomnre de patrouilles maritimes et de protections de convois. Des Spitfire Mk IIb arrivent en septembre 1941 et avec le renvoi dans le Sud en octobre, tous les appareils sont remplacés par des Spitfire Vb. Pendant 1 an, le Squadron opère depuis différentes bases du Sud de la Grande Bretagne et effectue des missions typiques de cette époque. Il retourne ensuite en Ecosse, à Drem et s'entraîne à décoller du pont du HMS Argus en vue de son départ Outre Mer.

Finalement le départ n'a pas lieu et en mars 1943 le Squadron s'installe à Perramporth. Il reçoit des Spitfire IX en août 1943 et en octobre il intègre le Group 83 / 2nd TAF et s'installe dans le Kent . En décembre 1943, les Mustang III remplacent les Spitfire et au début de 1944 le Squadron intègre le Wing 122 avec lequel il participe aux opérations sur la Normandie au cours de l'été 1944. Les nombreux combats aériens qui se déroulent permettent d'acquérir de nouvelles victoires, faisant passer le score de l'unité à 101,5 en date du 26 juillet. A cette même époque, le Squadron s'installe en France pour 1 mois puis en Belgique avant de rentrer en Grande Bretagne fin septembre.

Avec les autres Squadron du Wing, il est alors affecté à l'escorte des bombardiers et s'installe à Matlask avant d'être transféré à Andrews Field en octobre 1944. Les missions d'escorte se déroulent jusqu'en janvier, époque à laquelle le Squadron est transféré en Ecosse à Peterhead afin de mener des missions au profit du Coastal Command le long des côtes Norvégiennes. En mars, les Mustang IV remplacent les Mk III. Lorsque la guerre prend fin, le Squadron totalise 119,5 victoires.

Au début du conflit, un certain nombre de Spitfire affectés à l'unités avaient été fabriqués grace à des dons en provenance d'Inde. C'est ainsi que peu de temps après le Squadron prit la désignation de "East India"