Basé à Northolt au début de la guerre, le Squadron 25 est équipé de Blenheim If. Le 28 novembre 1939, le Squadron prend part à la première mission offensive de la guerre, en l'occurence le mitraillage de la base d'hydravions de Borkum sur l'ile de Sylt, conjointement avec le Squadron 601. Au début de 1940, le Squadron fait mouvement sur North Weald avec des détachements à Martlesham Heath. Le Squadron se lance alors dans la chasse de nuit et fait partie des premières unités à remporter des victoires de nuit avec pour seul alliée la lune. Le P/O Michael Herrick parviendra ainsi à abattre 3 bombardiers en deux nuits.

En septembre 1940, les premiers Beaufighter If arrivent et la première victoires est remportée le 15 novembre 1940. L'année 1941 permet de remporter un grand nombre de victoires, le Squadron opérant alors depuis Wittering dans le cadre du Group 12. Avec la fin du "Blitz" à la mi-1941, le Squadron reçoit quelques Havoc Iet en janvier 1942 il fait mouvement vers l'Irlande du Nord avant de retourner à Predannack en Cornouaille en mai 1942.

En octobre 1942 avec ses premiers Mosquito II, le Squadron entreprend ses premières missions Intruder sur le Sud Ouest de la France. Les Mark II sont renforcés en août par des Mark VI. En décembre 1943, le Squadron passe de la base de Coltishall à celle de Northolt et reçoit des Mosquito XVII. Les missions de nuit sont interrompues à l'été 1944 en raison du lancement d'un grand nombre de V-1 que des unités spécialisées sont chargées de détruire. Les Mosquito XXX arrivent en septembre et avec la réduction du nombre de V-1 tirés du fait de l'occupation des secteurs depuis lesquels ils étaient tirés, le Squadron peut reprendre ses activités de chasse de nuit.

En janvier 1945, le Squadron reçoit des Mosquito VI de chasse-bombardement et opère en Hollande et au Danemark pour des missions Intruder jusqu'à la fin de la guerre.